2017, Vol. 25
我国盐渍土的总面积大约为3 487万hm2, 耕地中有760万hm2发生不同程度的盐碱化, 约占总耕地面积的1/4。黑龙江省的盐碱地面积为116万hm2, 占全省总土地面积的3%[1-2], 且盐渍化的土壤面积和程度正在不断加重, 使设施蔬菜的生长和品质受到影响, 从而阻碍了我国设施蔬菜产业的发展[3]。黄瓜(Cucumis sativus L.)是我国设施蔬菜的主栽作物之一, 其根系再生能力较差, 耐盐性较弱, 如何减轻和克服土壤盐害是设施黄瓜生产中亟待解决的问题。研究表明, 嫁接可大大提高黄瓜的耐盐性[4], 且嫁接黄瓜操作简单、生产成本低、产品安全可靠, 因此, 采用嫁接提高黄瓜的耐盐性是切实可行的好方法。瓜类和茄科类蔬菜进行嫁接栽培是克服土壤盐渍化的一项有效措施[5]。
土壤环境的变化会影响到微生物群落组成、数量及其分布[6]。研究发现, 盐碱胁迫影响了土壤微生物的活性, 降低了微生物碳、氮量, 造成了微生物对有机质分解作用的下降[7], 同时还会影响植物生长、光合作用以及营养物质的吸收和转运[8], 因此土壤盐碱胁迫是影响作物生长发育和产量的主要非生物胁迫之一[9]。土壤微生物对土壤有机质分解和营养元素矿化起着重要作用, 是植物营养元素的活性库, 可作为评价土壤质量的重要指标之一[10]。研究表明, 土壤微生物数量随着土壤盐害程度的升高而降低, 细菌、放线菌数量与土壤全盐含量呈显著负相关, 细菌数量与土壤有机质含量呈极显著相关[11-14]。有研究表明, 同种植物的不同品种根系分泌物组成不同, 引起根际微生物群落结构的改变, 从而影响土壤养分的形成、积累以及植物的抗逆性等[15]。不同种类的砧木嫁接可不同程度地提高嫁接苗根际土壤细菌的多样性, 从而有助于提高西瓜[Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. et Nakai]嫁接苗的抗性[16]。嫁接可改变茄子(Solanum melongena L.)根际微生物种群数量和结构, 增加有益菌数量, 进而增强茄子的抗病性[17]。前人对蔬菜嫁接的研究多集中在抗病[18]、耐湿、耐低温上, 而关于抗盐[19], 尤其是砧木对复杂盐碱耐性及其作用机理研究还较少, 而关于同种植物的不同品种砧木嫁接对植物根际土壤微生物群落结构和丰度的影响与植物耐盐碱性是否存在一定的关系鲜见报道。
本研究旨在进一步明确设施蔬菜盐碱胁迫与土壤微生物的关系, 通过模拟黑龙江等地的设施盐碱土壤成分配制处理液, 采用PCR-DGGE技术研究盐胁迫对不同耐盐碱砧木嫁接黄瓜的土壤微生物群落结构和丰度的影响, 深入挖掘嫁接黄瓜的耐盐碱机理, 为盐碱地改良提供可靠的理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验试材试验于2013年2-11月于东北农业大学设施工程中心节能日光温室和园艺学院蔬菜生理生态研究室进行。
供试品种:黄瓜嫁接砧木采用耐盐碱的‘华砧108’(T1)、‘神力铁木砧’(T2)和盐碱敏感砧木‘辉太郎’(S1)、‘京欣砧6号’(S2)[20]; 接穗黄瓜品种为‘津春9号’, 由天津科润黄瓜研究所研制育成, ‘津春9号’黄瓜自根苗(CK)作对照。
供试土壤:取自东北农业大学设施工程中心大棚, 为多年瓜类连作黑土。基本理化性质为:有机质含量21.7 g·kg-1, 全氮含量0.125%, 碱解氮54.6 mg·kg-1, 速效磷36.94 mg·kg-1, 速效钾177.9 mg·kg-1, pH为7.37, EC为593 μS·cm-1。
1.2 试验设计黑龙江盐碱地主要盐分组成为NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3, 其中HCO3-含量占阴离子总量的一半左右, 且(CO32-+HCO3-)/(SO42-+Cl-)的质量比为1~2, 平均pH在8.72左右[13]。本试验采用盐浓度为100 mmol∙L-1、pH 9.0的盐碱液进行盐碱胁迫处理, 处理液配制各盐分摩尔比为NaHCO3:Na2SO4: NaCl:Na2CO3=4:2:2:0.15。试验选用2个耐盐碱和盐碱敏感黄瓜嫁接砧木T1、T2、S1、S2, 以‘津春9号’黄瓜自根苗作对照(CK), 共5个处理。每个重复12盆, 3次重复, 随机排列, 并设有保护行。
接穗黄瓜采用常规育苗, 嫁接采用插接法, 嫁接苗成活后待接穗长至3叶1心时, 定植到规格为180 mm×230 mm的塑料盆中, 每盆装土壤3 kg, 同时将磷酸二铵和硫酸钾两种化肥按质量比1:1混合施入, 每盆8 g, 定植后10 d每盆浇入1 L盐碱液, 保证每盆土壤中盐水的量浸透土壤而不渗出, 使其总盐终浓度为3.08 g∙kg-1, 其中NaHCO31.37 g∙kg-1, Na2SO4 1.16 g∙kg-1, NaCl 0.48 g∙kg-1, Na2CO3 0.065 g∙kg-1。为防止渗盐, 盆底无排水孔, 之后常规管理。分别在定植后30 d、40 d、50 d(盐碱胁迫20 d、30 d、40 d), 每个重复随机取3株黄瓜植株, 并用抖根法收集其根际土, 过80目筛, 保存于-80 ℃冰箱中, 用于根际土壤总DNA的提取。
1.3 测定项目与方法土壤总DNA的提取:采用Power Soil® DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratories, CA, USA)试剂盒对植株根际土壤微生物总DNA进行提取。土壤细菌16S rDNA的扩增采用对大多数细菌的16S rDNA通用的引物对GC-338f和518r进行PCR[21]。土壤真菌ITS区的扩增采用对大多数真菌的ITS区序列的通用引物ITS1-F、ITS4、GC-ITS1-F和ITS2进行巢式PCR[22]。
变性梯度凝胶电泳(DGGE):制备8%(细菌和真菌)的聚丙烯酰胺凝胶, 其中变性剂浓度从上到下依次增加。细菌变性剂浓度从40%到75%(100%的变性剂为7 mol·L-1的尿素和40%去离子甲酰胺)。用D-code System电泳仪(Bio-Rad Lab, LA, USA), 电压75 V, 温度60 ℃, 电泳12 h后, 将胶完整取出用1:3 300(v/v) GelRed (Biotium, USA)染色25 min。用UVP labwork 4.6成像系统照相。
土壤微生物总DNA的提取:采用Power Soil® DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratories, CA, USA)试剂盒对植物根际总DNA进行提取。
实时定量PCR分析采用IQ5 real-time PCR system (Bio-Rad Lab, LA, USA)。
1.4 数据分析试验中原始数据的整理采用Microsoft Excel (Office 2010)软件完成; 数据处理采用SAS 8.1软件, 方差分析使用ANOVA过程, 聚类分析使用SPSS 16.0软件。DGGE的指纹图谱分析采用Bio-Rad Quantityone 4.5软件对DGGE图谱进行数字化、标准化分析, 主成分分析采用Canoco for Windows 4.5 software[23]。
2 结果与分析 2.1 不同耐盐碱性砧木嫁接苗根际土壤微生物群落结构的差异 2.1.1 土壤细菌群落结构的差异从图 1可知, 在定植后30 d(盐碱胁迫20 d), 不同耐盐碱性砧木嫁接苗根际土壤细菌DGGE图谱无明显差异。主成分分析的两个主要成分PC1和PC2分别代表总变量的26.5%和14.5%。自根苗CK的散点位置与嫁接苗各处理的散点位置距离较远, 说明自根苗的根际土壤细菌群落结构与嫁接苗处理存在差异, 但是耐盐碱砧木嫁接苗和盐碱敏感处理散点分布比较均匀, 说明在盐碱胁迫20 d时, 耐盐碱性不同的砧木嫁接苗根际土壤细菌结构组成相似。
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图 1 定植后30 d(盐碱胁迫20 d)不同砧木黄瓜嫁接苗根际土壤细菌DGGE图谱(a)及其主成分分析图(b) Figure 1 DGGE profile (a) and PCA analysis (b) of the rhizosphere soil bacteria of grafted cucumber with different rootstocks after 30 days planting (20 days saline-alkali stress) T1和T2为抗盐砧木‘华砧108’和‘神力铁木砧’, S1和S2为盐敏感砧木‘辉太郎’和‘京欣砧6号’, CK为黄瓜自根苗。 T1 and T2 are saline-alkali tolerant cucumber rootstocks of 'Huazhen108' and 'Shenlitiemuzhen'; S1 and S2 are saline-alkali sensitive cucumber rootstocks of 'Huitailang' and 'Jingxinzhenliuhao'; CK is own-root seedling of cucumber. |
从图 2可知, 在定植后40 d(盐碱胁迫30 d), 不同耐盐碱性砧木嫁接苗根际土壤细菌DGGE图谱无明显差异。PCA分析图 2耐盐碱的砧木嫁接苗(T1、T2)的散点距其他处理较远, 盐碱敏感的砧木嫁接苗散点位置相近, 但与自根苗有一定距离, 说明耐盐碱性不同的砧木嫁接苗以及自根苗对照间的根际土壤细菌群落结构组成产生较大差异。
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图 2 定植后40 d(盐碱胁迫30 d)不同砧木黄瓜嫁接苗根际土壤细菌DGGE图谱(a)及其主成分分析图(b) Figure 2 DGGE profile (a) and PCA analysis (b) of the rhizosphere soil bacteria of grafted cucumber with different rootstocks after 40 days planting (30 days saline-alkali stress) T1和T2为抗盐砧木‘华砧108’和‘神力铁木砧’, S1和S2为盐敏感砧木‘辉太郎’和‘京欣砧6号’, CK为黄瓜自根苗。 T1 and T2 are saline-alkali tolerant cucumber rootstocks of 'Huazhen108' and 'Shenlitiemuzhen'; S1 and S2 are saline-alkali sensitive cucumber rootstocks of 'Huitailang' and 'Jingxinzhenliuhao'; CK is own-root seedling of cucumber. |
从图 3可知, 在定植后50 d(盐碱胁迫40 d), 不同耐盐碱性砧木嫁接苗根际土壤细菌DGGE图谱无明显差异。PCA分析图中耐盐碱的砧木嫁接苗T1与T2的散点基本在同一象限, 盐碱敏感的砧木嫁接苗散点位置与自根苗有一定距离, 说明耐盐碱性不同的砧木嫁接苗以及自根苗对照间的根际土壤细菌群落结构组成产生较大差异。
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图 3 定植后50 d(盐碱胁迫40 d)不同砧木黄瓜嫁接苗根际土壤细菌DGGE图谱(a)及其主成分分析图(b) Figure 3 DGGE profile (a) and PCA analysis (b) of the rhizosphere soil bacteria of grafted cucumber with different rootstocks after 50 days planting (40 days saline-alkali stress) T1和T2为抗盐砧木‘华砧108’和‘神力铁木砧’, S1和S2为盐敏感砧木‘辉太郎’和‘京欣砧6号’, CK为黄瓜自根苗。 T1 and T2 are saline-alkali tolerant cucumber rootstocks of 'Huazhen108' and 'Shenlitiemuzhen'; S1 and S2 are saline-alkali sensitive cucumber rootstocks of 'Huitailang' and 'Jingxinzhenliuhao'; CK is own-root seedling of cucumber. |
如表 1所示, 在定植30 d(盐碱胁迫20 d)时, 自根苗对照(CK)的根际土壤细菌DGGE图谱条带数显著高于耐盐碱性砧木嫁接苗(T2) (P < 0.05), 而各处理间的Shannon-Wiener指数与均匀度指数均没有差异。在定植40 d(盐碱胁迫30 d)时, 各处理间的条带数没有差异; 耐盐碱性砧木嫁接苗(T1)的Shannon-Wiener指数与均匀度指数均显著高于盐碱敏感砧木嫁接苗(S1) (P < 0.05)。在定植50 d(盐碱胁迫40 d)时, 自根苗对照(CK)的条带数显著高于盐碱敏感砧木嫁接苗(S1);耐盐碱性砧木嫁接苗(T2)的Shannon-Wiener指数与均匀度指数均显著高于盐碱敏感砧木嫁接苗(S1) (P < 0.05)。
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表1 盐碱胁迫下不同耐盐碱性黄瓜砧木嫁接对不同取样时间土壤细菌DGGE图谱的条带数和多样性指数的影响 Table 1 Effect of rootstock varieties of cucumber on soil bacteria DGGE profile band number and diversity indexes at different sampling times under saline-alkali stress |
从图 4可知, 定植后30 d(盐碱胁迫20 d), 不同耐盐碱性砧木嫁接苗根际土壤真菌DGGE图谱无明显差异。PCA分析图中耐盐碱的砧木嫁接苗T1与T2的散点距离较近, 距离自根苗(CK)和盐碱敏感的砧木嫁接苗S1、S2较远, 说明两个耐盐碱的砧木嫁接苗根际土壤真菌群落结构差异不大, 但与其他处理, 特别是自根苗的根际土壤真菌群落结构组成产生较大差异。
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图 4 定植后30 d(盐碱胁迫20 d)不同砧木黄瓜嫁接苗根际土壤真菌DGGE图谱(a)及其主成分分析图(b) Figure 4 DGGE profile (a) and PCA analysis (b) of the rhizosphere soil fungi of grafted cucumber with different rootstocks after 30 days planting (20 days saline-alkali stress) T1和T2为抗盐砧木‘华砧108’和‘神力铁木砧’, S1和S2为盐敏感砧木‘辉太郎’和‘京欣砧6号’, CK为黄瓜自根苗。 T1 and T2 are saline-alkali tolerant cucumber rootstocks of 'Huazhen108' and 'Shenlitiemuzhen'; S1 and S2 are saline-alkali sensitive cucumber rootstocks of 'Huitailang' and 'Jingxinzhenliuhao'; CK is own-root seedling of cucumber. |
从图 5可知, 在定植后40 d(盐碱胁迫30 d), 不同耐盐碱性砧木嫁接苗根际土壤真菌DGGE图谱无明显差异。PCA分析图中耐盐碱的砧木嫁接苗T1与T2的散点在同一象限, 盐碱敏感(S1、S2)的散点基本在同一象限, 而与自根苗(CK)的散点距离比较远, 说明嫁接苗与自根苗的根际土壤真菌群落结构组成存在较大差异, 每个处理的3个散点位置比较集中, 说明各处理重复性比较好。
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图 5 定植后40 d(盐碱胁迫30 d)不同砧木黄瓜嫁接苗根际土壤真菌DGGE图谱(a)及其主成分分析图(b) Figure 5 DGGE profile (a) and PCA analysis (b) of the rhizosphere soil fungi of grafted cucumber with different rootstocks after 40 days planting (30 days saline-alkali stress) T1和T2为抗盐砧木‘华砧108’和‘神力铁木砧’, S1和S2为盐敏感砧木‘辉太郎’和‘京欣砧6号’, CK为黄瓜自根苗。 T1 and T2 are saline-alkali tolerant cucumber rootstocks of 'Huazhen108' and 'Shenlitiemuzhen'; S1 and S2 are saline-alkali sensitive cucumber rootstocks of 'Huitailang' and 'Jingxinzhenliuhao'; CK is own-root seedling of cucumber. |
从图 6可知, 在定植后50 d(盐碱胁迫40 d), 不同耐盐碱性砧木嫁接苗根际土壤真菌DGGE图谱无明显差异。PCA分析图中耐盐碱的砧木嫁接苗T1与T2的散点比较集中, 与盐碱敏感的S2基本在同一象限, S1和S2的散点位置有一定距离, 说明这2个砧木品种土壤真菌有一定差异; 砧木嫁接苗与自根苗(CK)的散点距离较远, 说明砧木嫁接苗与自根苗对照存在较大差异。
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图 6 定植后50 d(盐碱胁迫40 d)不同砧木黄瓜嫁接苗根际土壤真菌DGGE图谱(a)及其主成分分析图(b) Figure 6 DGGE profile (a) and PCA analysis (b) of the rhizosphere soil fungi of grafted cucumber with different rootstocks after 50 days planting (40 days saline-alkali stress) T1和T2为抗盐砧木‘华砧108’和‘神力铁木砧’, S1和S2为盐敏感砧木‘辉太郎’和‘京欣砧6号’, CK为黄瓜自根苗。 T1 and T2 are saline-alkali tolerant cucumber rootstocks of 'Huazhen108' and 'Shenlitiemuzhen'; S1 and S2 are saline-alkali sensitive cucumber rootstocks of 'Huitailang' and 'Jingxinzhenliuhao'; CK is own-root seedling of cucumber. |
在定植30 d和40 d(盐碱胁迫20 d和30 d)时, 各处理间的条带数、Shannon-Wiener指数和均匀度指数均没有差异(P < 0.05)。在定植50 d(盐碱胁迫40 d)时, 耐盐碱性砧木嫁接苗(T1、T2)的条带数显著高于盐碱敏感砧木嫁接苗(S2)和自根苗对照(CK) (P < 0.05);耐盐碱性砧木嫁接苗(T2)的Shannon-Wiener指数与均匀度指数均显著高于盐碱敏感砧木嫁接苗(S1、S2)和自根苗对照(CK) (P < 0.05) (表 2)。
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表2 盐碱胁迫下不同耐盐碱性黄瓜砧木嫁接对不同取样时间土壤真菌DGGE图谱的条带数和多样性指数的影响 Table 2 Effect of rootstock varieties of cucumber on soil fungi DGGE profile band number and diversity indexes at different sampling times under saline-alkali stress |
图 7A结果表明, 随着黄瓜生长, 真菌ITS基因拷贝数呈增加趋势。在定植30 d(盐碱胁迫20 d), 盐碱敏感砧木嫁接苗(S1)的真菌ITS基因拷贝数要显著低于其他处理及自根苗对照。在定植40 d(盐碱胁迫30 d), 耐盐碱砧木嫁接苗(T2)的真菌ITS基因拷贝数要显著高于盐碱敏感砧木嫁接苗(S1、S2)以及黄瓜自根苗对照(CK)。在定植50 d(盐碱胁迫40 d), 耐盐碱砧木嫁接苗(T1、T2)处理的真菌ITS基因拷贝数要显著高于盐碱敏感砧木嫁接苗(S1、S2)处理, 与自根苗对照差异不显著。在定植30~50 d, 盐碱敏感的S1处理的真菌ITS基因拷贝数均低于其他处理及自根苗对照。
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图 7 盐碱胁迫下不同耐盐碱性黄瓜砧木嫁接对不同取样时间土壤真菌(A)和细菌(B)群落丰度的影响 Figure 7 Effect of rootstock varieties of cucumber on soil fungi (A) and bacteria (B) community abundance at different sampling times under saline-alkali stress T1和T2为抗盐砧木‘华砧108’和‘神力铁木砧’, S1和S2为盐敏感砧木‘辉太郎’和‘京欣砧6号’, CK为黄瓜自根苗。同一取样时间不同小写字母表示不同处理间差异显著(P < 0.05)。 T1 and T2 are saline-alkali tolerant cucumber rootstocks of 'Huazhen108' and 'Shenlitiemuzhen'; S1 and S2 are saline-alkali sensitive cucumber rootstocks of 'Huitailang' and 'Jingxinzhenliuhao'; CK is own-root seedling of cucumber. Different lowercase letters for the same sampling time mean significant differences at 0.05 level among different treatments. |
由图 7B看出, 随着黄瓜生长, 细菌16S rDNA基因拷贝数呈缓慢上升趋势, 在定植30 d(盐碱胁迫20 d), 自根苗的细菌16S rDNA基因拷贝数显著高于耐盐碱砧木(T1、T2)(P < 0.05);在定植40 d时(盐碱胁迫30 d), 自根苗与耐盐碱性砧木T1、T2的细菌16S rDNA基因拷贝数要显著高于盐碱敏感砧木品种S1(P < 0.05);在定植50 d(盐碱胁迫40 d), 耐盐碱砧木T1的土壤细菌数量显著高于其他处理(P < 0.05)。
3 讨论与结论土壤微生物是土壤环境条件变化的敏感指标, 土壤质量在一定程度上由土壤微生物的群落结构和多样性来反映[24]。根际土壤微生物种群数量和比例能够影响植物的生长状况和产量、土壤的健康程度以及土传病害发生的几率和危害程度[25]。土壤细菌是土壤微生物的重要组成部分, 它在数量和种类上超过其他土壤有机体, 并能分解各种有机物质。有研究表明, 盐碱胁迫会在一定程度上破坏土壤中的微生物群落结构, 降低土壤中细菌的含量[26]。真菌是常见的土壤微生物之一, 可以分解纤维素、淀粉、树胶、木质素以及较易分解的蛋白质和糖类, 在腐殖质的形成过程和土壤团粒的稳定中发挥着重要作用。不同砧木黄瓜嫁接苗及自根苗的根际土壤细菌与真菌DGGE图谱存在许多共同条带, 表明具有这些条带基因的土壤微生物不受砧木嫁接、采样时期和盐碱处理的影响, 在土壤中比较稳定, 与包静[27]的研究结果一致。对土壤细菌与真菌DGGE图谱数据化处理后进行主成分分析, 结果表明, 耐盐碱性不同的砧木嫁接苗PCA散点距离随着盐碱胁迫时间的增加而加大, 土壤微生物群落结构产生了较大差异, 这与赵久成[16]的研究结果相吻合。
土壤微生物多样性影响土壤生态系统的结构、功能及过程, 是维持土壤生产力的重要组分[28], 微生物群落结构研究中常用的指数包括均衡性指数、丰富性和多样性指数[29]。本试验研究结果发现, 耐盐碱性砧木嫁接苗根际土壤真菌和细菌的Shannon-Wiener指数与均匀度指数均显著高于盐碱敏感的砧木嫁接苗和自根苗对照, 表现出不同耐盐碱性砧木品种间根际土壤真菌和细菌群落结构的变化, 该结果与吴凤芝等[15]的研究结果一致。前人研究表明, 在盐胁迫条件下, 耐盐黄瓜品种真菌ITS和细菌16S rDNA基因拷贝数高于盐敏感品种, 在定植后30 d和50 d达到显著水平(P < 0.05)[3]。本研究中, 在盐碱胁迫条件下, 随着黄瓜生长, 真菌ITS基因拷贝数呈增加趋势。在定植50 d, 耐盐碱砧木T1、T2的土壤真菌ITS基因拷贝数呈显著增高趋势, 耐盐碱砧木T1的土壤细菌16S rDNA基因拷贝数也显著高于其他处理, 表现出品种间显著差异, 说明盐碱胁迫可能在一定程度上抑制土壤有机质的分解与腐殖质的形成, 从而改变真菌和细菌的数量。这可能是由于耐盐碱能力不同的砧木品种根系分泌物的组成与含量不同, 从而使植株根际真菌和细菌的数量产生差异, 该结果与Ling等[30]的研究结论具有相似性。
由此可见, 随着盐碱胁迫时间的增加, 不同耐盐碱性砧木嫁接苗的根际土壤微生物群落结构差异逐渐显现, 可能是由于盐碱成分影响了土壤理化性状以及植物根系的生长, 不同植株生长受到的抑制程度不同, 同时, 植物根系分泌有益物质发生变化, 导致土壤微生物的生长繁殖受到不同程度影响[31-32], 因此, 不同耐盐碱性砧木嫁接苗土壤微生物群落结构产生了较大差异。耐盐碱的品种可能正是由于通过改善其土壤中微生物的数量及丰富度来加强自身的耐盐碱性。本试验采用荧光定量与PCR-DGGE方法相结合研究盐碱胁迫对不同砧木嫁接苗根际土壤细菌和真菌群落结构与丰度的影响, 土壤真菌与细菌群落丰度和DGGE图谱条带数变化趋势基本一致, 这也进一步说明两种方法的结合能够说明土壤微生物的动态变化, 为黄瓜在盐碱地的优质高产提供了理论依据。
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