2017, Vol. 25
2. 新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所 乌鲁木齐 830091;
3. 新疆农业科学院微生物应用研究所 乌鲁木齐 830091;
4. 西北农林科技大学资源环境学院 杨凌 712100
2. Institute of Soil, Fertilizer & Agricultural Water Saving, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Urumqi 830091, China;
3. Institute of Microbiology, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Urumqi 830091, China;
4. College of Natural Resources and Environment, Northwest A & F University, Yangling 712100, China
XUE Quanhong, E-mail: xuequanhong123@163.com
我国商品棉产区连作种植现象普遍存在。在集约化种植条件下, 棉花 (Anemone vitifolia Buch.) 长期连作引起的连作障碍和枯、黄萎病等土传病害有蔓延趋势, 已成为棉花种植业亟待解决的重大问题。连作障碍的本质是土壤根际微生态系统失调或恶化[1]。目前化学农药大量使用引起的药物残留、污染环境、易使病原菌产生抗药性积累等问题已不符合农业健康可持续发展的要求。生物防治及生态调控因其环境友好、无药物残留, 有望从根本上防控土传病害, 但防治效果与生防菌在土壤中的数量和定殖能力有关[2-4]。
目前, 生防放线菌对作物根域土壤微生态的影响和对作物的防病促生作用已有很多报道[5-8]。但在实验室有明显抑菌作用的生防菌在盆栽和田间施用时, 受生防制剂本身、病原物、寄主植物和环境因子 (如土壤中营养源、温度、盐浓度、渗透性及pH等) 影响较大, 进而导致其在土壤中的定殖能力和防病效果不稳定[9]。而利用添加无机或有机物料作为生防菌的营养和固定载体, 将帮助生防菌有效地在土壤中定殖, 使其形成优势种群, 协助生防菌达到更好的防治效果[10-11]。当前使用较多的微生物载体有草炭、蛭石、硅藻土、海藻酸钠等无机物料及菌糠、粪便等各种有机废弃物等[12-15], 但也存在负面影响[11, 16]。
生物炭 (biochar) 是生物质在限氧条件下低温裂解产生的稳定富炭固体, 可用秸秆及木屑等农林废弃物生产[17-18], 具有发达的孔隙度、巨大的比表面积和较强的吸附养分的能力, 为土壤微生物提供栖息地, 能改善土壤微生物群落结构, 促进微生物多样性, 提高土壤微生物活性[19-20]。生物炭作为优良的功能性微生物载体已受到国内外学者的关注。添加生物炭能增加土壤中菌根真菌[21]、固氮菌类群[22]及Enterobacter cloacae[23]、Bacillus mucilaginosus[24-26]等有益微生物的数量。但Aeron等[27]比较土壤、木炭、木屑和木屑土, 发现木屑土是Pseudomonas fluorescens PS1最有效的载体。因此需要对生物炭作为微生物载体的功能进行深入研究。
研究表明生物炭可通过调控土壤微生态环境, 缓解连作障碍, 对部分植物及土传病害有一定的防控作用[28-30], 但也存在一些争议[31]。因此利用生防菌剂配施生物炭来缓解防控连作障碍和土传病害已成为科研工作者研究的新方向[32]。那么生防菌配施棉秆炭对连作棉田土壤微生态影响如何？此方面的研究目前少见报道。因此, 研究配施棉秆炭对土壤中生防放线菌数量的影响, 及生防放线菌配施棉秆炭对连作棉田土壤微生态的影响具有重要意义。鉴于大田条件复杂多变, 难以精确控制, 本试验采用模拟法研究在施用一定生防放线菌的基础上, 添加不同量的棉秆炭所引起的棉田连作土壤中生防放线菌和微生物区系的变化, 以探索生防菌配施棉秆炭对增加生防放线菌数量、提高其防病促生效果的可行性及技术措施, 为生防放线菌配施棉秆炭防治棉花土传病害提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料棉秆炭由新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所提供。棉花秸秆在500 ℃厌氧条件处理3 h备用, 粉碎后过0.5 mm筛。棉秆炭粒径 (D) 组成中, 0.25 mm < D < 0.5mm占52%, D < 0.25 mm占48%。其基本理化性质为有机碳771.80 g·kg-1, 全氮15.72 g·kg-1, 全磷15.31 g·kg-1, 全钾25.04 g·kg-1, pH 10.27, 电导率4.38 mS·cm-1。
供试土壤采自河北省景县连作6年棉田。选取6个采样点, 采集棉花根区土0~20 cm耕层土壤, 风干后混匀, 研磨过0.5 cm筛备用。
供试生防放线菌为编号25#的黄三素链霉菌 (Streptomyces flavotricini) 为西北农林科技大学资源环境学院微生物资源研究室分离筛选, 对棉花黄萎病病原菌有较好抗性[33]。试验所用粉状活菌制剂采用固态发酵、低温烘干制备, 活菌数为5.3×109cfu·g-1。
1.2 方法 1.2.1 土壤接种模拟试验试验设0 g·kg-1(CK)、25.0 g·kg-1、50.0 g·kg-1、100.0 g·kg-1 4个棉秆炭用量处理, 所有处理均接入25#生防菌剂, 接入量为5.3×106cfu·g-1(干土)。
定量称取100 g土样, 按比例加入棉秆炭后置于300 mL广口瓶中, 搅拌均匀后直接加入25#生防菌剂混匀。每个处理3次重复。每瓶加26 mL无菌水, 封口28 ℃培养, 培养期间采用等重加水法使每瓶质量相同, 培养15 d后将瓶内土壤充分混匀, 每瓶称取10.0 g进行土壤微生物数量测定及种类分析。
1.2.2 土壤微生物分离计数不同处理土样均采用稀释平板涂抹法分离计数。细菌、真菌及放线菌所用培养基分别为牛肉膏蛋白胨培养基 (BPA)、高氏1号培养基 (GA) 和马铃薯蔗糖培养基 (PDA)[33]。为防止细菌生长, GA培养基中灭菌前加入1 g·L-1重铬酸钾至80 μg·mL-1, PDA培养基中加入灭菌乳酸至终浓度为3 mL·L-1。细菌、放线菌及真菌分别于培养2~3 d、5~7 d及3~5 d后计数; 再对单菌落的形态特征进行观察分析, 将皿内形态特征完全相同菌落定为同一分类单元, 并将数量多、比例高 (占总数的5%左右) 的微生物定为优势菌。在对每种优势菌计数后挑取单菌落进行纯化、保藏、鉴定。
1.2.3 细菌菌种鉴定对挑取的细菌, 根据形态特征结合16S rDNA序列分析进行鉴定。采用酶解法提取细菌总DNA[34]。引物采用正向引物PA: 5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′; 反向引物PB: 5′-AAGGAGGTGATCCAG CCGCA-3′。扩增条件: 94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性1 min, 56 ℃退火1 min; 72 ℃延长2 min, 变性到延长30个循环; 72 ℃延长10 min, 4 ℃保存。扩增产物胶纯化后送南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序。将获得序列与GenBank数据库中序列进行比对。
1.3 结果计算及数据统计分析试验数据中, 棉秆炭效应 (ΔCK%) 表示添加棉秆炭土壤中不同菌群的增幅; PB(%) 表示土壤中优势细菌占分离细菌总数的比例, PA(%) 表示土壤中小单孢菌、链霉菌、生防菌占分离放线菌总数的比例, PF(%) 表示土壤中优势真菌占分离真菌总数的比例, CB(%) 表示添加棉秆炭土壤中优势细菌的增幅。所有试验数据均利用SAS统计软件进行方差分析, 并采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。
2 结果与分析 2.1 生防菌剂配施棉秆炭对连作棉田土壤中微生物数量和比例的影响由表 1可知, 生防菌剂配施棉秆炭使连作棉田土壤中细菌、真菌和放线菌数量显著增加。与单施菌剂处理 (CK) 相比, 25.0 g·kg-1和100.0 g·kg-1棉秆炭配施处理土壤中细菌数量显著增加7 103.8%和8 640.7%(P < 0.05)。真菌和放线菌数量随棉秆炭添加量的增加比例逐渐增大。25.0 g·kg-1、50.0 g·kg-1和100.0 g·kg-1配施处理中真菌与放线菌数量分别显著增加34.2%与75.5%、469.6%与165.1%和2 289.4% 366.3%(P < 0.05)。
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表1 生防菌配施不同量棉秆炭对连作棉田土壤中微生物数量的影响 Table 1 Populations of soil microorganisms in different treatments of biochar under application of antagonistic actinomycetes |
从表 2看出, 生防菌剂配施棉秆炭连作棉田土壤中微生物组成有较大变化。与单施放线菌菌剂相比, 25.0 g·kg-1配施棉秆炭处理使土壤中细菌/真菌数量比 (B/F)、放线菌/真菌数量比 (A/F) 和细菌/放线菌数量比 (B/A) 分别增加了5271.2%、30.8%和3996.0%, 50.0 g·kg-1配施棉秆炭处理使土壤中B/F和A/F分别减少了32.0%和53.4%, 而B/A增加了45.7%。100.0 g·kg-1配施棉秆炭处理使土壤中的B/F和B/A分别增加了266.0%和1 768.8%, 而A/F减少了80.5%。
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表2 生防菌配施不同量棉秆炭对连作棉田土壤中3大微生物类群比例的影响 Table 2 Ratios of three major microorganism groups of soil in different treatments of biochar under application of antagonistic actinomycetes |
从土壤中分离出的细菌种类和数量上来看, 主要以芽孢杆菌居多, 对其中5株数量较多的芽孢杆菌进行分子鉴定 (表 3)。
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表3 连作棉田土壤中优势细菌菌落形态特征及分子鉴定 Table 3 Predominant bacteria in soil of continuous cropped cotton |
由表 4可知, 连作棉田土壤在添加生防菌剂后配施不同量棉秆炭改变了土壤中优势细菌的种类、数量及比例。单施生防菌剂土壤中YB1和YB3细菌分别占分离细菌总数的3.8%和3.8%。而添加棉秆炭使这2种优势细菌数量增加, 其中25.0 g·kg-1和100.0 g·kg-1棉秆炭处理使土壤中YB1和YB3数量分别较对照增加170.6倍、150.9倍和18.6倍、3.9倍, 均达到显著水平 (P < 0.05);但50.0 g·kg-1棉秆炭处理YB1菌株数量增幅不大, YB3菌株数量甚至减少。YB5、YB6和YB7菌株在对照土壤中未检出, 而25.0 g·kg-1、50.0 g·kg-1和100.0 g·kg-1棉秆炭处理中YB5菌株数量分别占分离细菌总数的5.1%、5.7%和7.4%; YB6菌株数量分别占分离细菌总数的6.7%、11.0%和3.2%; YB7菌株数量分别占分离细菌总数的4.1%、7.2%和2.8%。
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表4 生防菌配施不同量棉秆炭连作棉田土壤中优势细菌数量及比例 Table 4 Predominant bacteria population and proportion of soil in different treatments of biochar under application of antagonistic actinomycetes |
由表 5可以看出, 与单接生防菌剂相比, 所有棉秆炭配施处理均使土壤中小单孢菌和链霉菌数量分别增加25.3%~85.8%和44.4%~1 372.9%, 其中100.0 g·kg-1棉秆炭配施处理使小单孢菌、链霉菌数量分别较无炭对照显著增加76.0%、1 372.9% (P < 0.05)。
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表5 生防菌配施不同量棉秆炭连作棉田土壤中小单孢菌、链霉菌和接入生防菌 (黄三素链霉菌) 数量及比例 Table 5 Populations and ratios of soil Micromonospora sp., Streptomyces sp. and Streptomyces flavotricini in different treatments of biochar under application of antagonistic actinomycetes |
由表 5看出, 棉秆生物炭对接入的生防菌数量影响显著。添加生物炭后, 土壤中生防放线菌黄三素链霉菌数量较无棉秆炭对照增加49.8%~2 672.8%, 并使该菌在可培养放线菌总数中所占比例达到49.4%。
从比例来看, 棉秆炭配施处理使3种放线菌占分离放线菌总数的比例与数量呈现不同变化。与单施生防菌剂相比, 棉秆炭处理使小单孢菌占放线菌分离总数比例为8.6%~16.2%, 始终低于对照, 且比例随棉秆炭用量的增加比例降低。25.0 g·kg-1和50.0 g·kg-1棉秆炭配施处理使链霉菌占放线菌分离总数比例分别为16.6%和17.5%, 分别较对照降低了17.4%和12.9%;而100.0 g·kg-1棉秆炭配施处理的比例为63.5%, 较对照增加215.9%。25.0 g·kg-1棉秆炭配施处理使25#菌剂 (黄三素链霉菌) 占放线菌分离总数比例为7.1%, 较对照降低; 而100.0 g·kg-1棉秆炭配施处理使这一比例为49.4%, 显著高于对照。
2.4 生防菌剂配施棉秆炭对连作棉田土壤真菌类群分布的影响从土壤中分离出的真菌种类和数量上来看, YF1、YF2和YF3菌株检出数量大部分超过分离菌株总数的5%, 为连作棉田土壤中优势真菌菌群。经菌落和孢子形态特征初步鉴定这3株菌分别为米曲霉、黑曲霉和木霉。由表 6、表 7可知, 生防菌剂配施棉秆炭改变了连作棉田土壤中优势真菌的数量及比例。与单施生防菌剂相比, 除50.0 g·kg-1棉秆炭配施处理使YF2数量减少外, 25.0 g·kg-1、50.0 g·kg-1和100.0 g·kg-1棉秆炭配施处理均使土壤中3种优势真菌数量增加, 其中100.0 g·kg-1棉秆炭配施处理分别显著增加455.5%、244.8%和8 936.1%(P < 0.05)。但这3株优势真菌在分离真菌中所占的比例总体上随棉秆炭施入量的增加而减少, 这有可能是棉秆炭增加了土壤中真菌总数所致。
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表6 连作棉田土壤中优势真菌菌落形态特征 Table 6 Predominant fungi in soil of continuous cropped cotton |
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表7 生防菌配施不同量棉秆炭连作棉田土壤中优势真菌数量及比例 Table 7 Predominant fungi populations and percents of soil in different treatments of biochar under application of antagonistic actinomycetes |
生防放线菌由于耐受性差、生长缓慢等特点并不利于发展活体制剂, 且制备中存在不易繁殖, 产孢量低, 或多代繁殖后防治效果下降等问题。其生防活性在防治过程中也容易受到环境和营养因素的影响, 存在稳定性和持效性较差等问题[35]。因此选择合适的营养物质、载体或与其他肥料配施从而发挥最大的生防活性将成为生防放线菌应用的关键问题。
目前常用泥炭、蛭石等无机矿物质作为生防菌的载体, 但这些物质存在储量有限、分布不均及开采过程容易引起环境问题[11]。有机营养载体也存在有害生物的影响、重金属和盐分的积累、抗生素的残留等负面作用[16]。生物炭为秸秆、稻壳、竹木和动物粪便等有机废弃物料在限氧或绝氧条件下, 通过300~700 ℃高温裂解而来[18], 由于生产原料来源广泛, 近些年来作为一种新型生防菌载体材料而被人们所关注。虽然生物炭结构中的苯环有很高的稳定性, 但其中脂肪族和氧化态碳物质易于腐解, 且本身含有大量N、P、K、Ca、Mg等可利用养分, 可能被微生物分解利用[36-37]; 但也有研究表明作为碳源或基质, 生防真菌木霉菌对生物炭的利用效果没有葡萄糖、乳糖和淀粉的效果好[38]; 有些生物炭甚至还可能对微生物繁殖具有潜在抑制作用[39]。此外由于生物炭具有多孔性, 能够为微生物生存提供附着位点和较大空间, 可作为植物益生菌或其他微生物的良好载体[25, 40-41]; 其较强的吸附性, 可以吸附土壤中的养分, 给生防菌提供良好的生存环境[42-43]。本研究表明生防放线菌与棉秆炭配施能改善连作棉田土壤微生物群落结构, 增加生防放线菌黄三素链霉菌的数量。因此棉秆炭可以作为生防放线菌良好的载体, 具有较大的生防潜力。但生物炭的种类、不同条件制备的生物炭及生物炭的添加量等因素均影响生物炭作为微生物载体的应用效果[25, 42, 44]。与单施生防放线菌的对照相比, 施入棉秆炭使土壤中生防放线菌黄三素链霉菌的数量增加。由于施入棉秆炭使土壤pH增高, 而生防放线菌数量随棉秆炭施入量增加而增加, 推测原因可能由于生防放线菌在偏碱性环境下也能生长良好, 故能明显提高棉秆炭高施用量条件下生防菌的数量。
同时生物炭的输入也改变了单接生防菌剂土壤中微生物菌群的变化, 生物炭的施用量对土壤中细菌、放线菌和真菌数量有显著的影响。武爱莲等[45]研究表明在5~60 g·kg-1玉米秸秆生物炭范围内, 能显著增加土壤中细菌的数量, 增幅随其用量的增加而增加; 但顾美英等[46]的研究表明土壤中细菌、放线菌和真菌数量随生物炭施入量的增加呈先增加后减少的趋势。本研究表明, 与单施生防菌的对照相比, 配施棉秆炭也显著提高了连作棉田土壤中细菌、放线菌和真菌数量, 且有随棉秆炭加入量增加呈增加-降低-增加的趋势。100.0 g·kg-1施入量微生物数量增幅明显, 可能是土壤中生防放线菌数量的显著增加, 抑制了土传病原菌的数量, 土壤环境得到改善, 微生物数量也随之增加, 但这个高施用量对棉花的生长是否有影响, 还需进行棉花种植试验验证。生防菌剂配施棉秆炭处理使土壤中细菌和放线菌数量较真菌数量相对增加, 细菌/真菌数量比 (B/F) 和放线菌/真菌数量比 (A/F) 随棉秆炭施入量的增加而降低, 对微生物群落结构有明显的调节作用, 使连作棉田土壤向细菌性土壤转变, 但这种变化是否是由生防菌数量增高引起, 还是生物炭的作用, 还需设置不施生防菌和不施棉秆炭的对照来进一步说明。
此外生防菌剂配施棉秆炭对不同的微生物种类也有不同的影响。本研究连作棉田土壤经生防菌剂配施棉秆炭共分离得到5株优势细菌, 均为芽孢杆菌属 (Bacillus)。其中B. oceanisediminis菌数量随棉秆炭施入量增加而增加, B. bingmayongensis菌数量则减少, 其余3株则呈现先增加后减少的趋势。芽孢杆菌是植物病害生防微生物的重要组成部分, 具有显著的生防潜力, 它可以防治多种植物病害[47-49]。而蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus) 在3种浓度梯度棉秆炭处理的土壤中均有分离得到, 而在对照土壤中未检出。有学者指出蜡样芽孢杆菌对作物有防病、促生及杀菌作用[50-51]。随棉秆炭施入量增加, 放线菌中小单孢菌数量及比例降低, 但链霉菌及接入生防菌剂的数量及比例增加。真菌中益生木霉数量也有所增加。由此推断在施用生防菌剂的基础上配施一定比例棉秆炭可促进土壤中有益细菌、放线菌和真菌的数量与比例。这些是否对缓解棉花连作障碍有积极影响, 要对病原菌数量和优势微生物做深入分析。由于本研究为土壤培养试验, 缺少作物根系的影响, 还需进行田间试验验证。
4 结论生防放线菌配施棉秆炭对连作棉田土壤中微生物区系有显著影响。与单施生防放线菌菌剂的处理相比, 土壤中生防放线菌数量随着棉秆炭施用量增加而显著增加, 棉秆炭具有作为生防放线菌良好载体的潜力。同时生防放线菌配施棉秆炭也显著提高了连作棉田土壤中微生物的数量且改变了优势微生物数量和比例, 尤其提高了细菌中芽孢杆菌的数量和所占的比例; 100.0 g·kg-1棉秆炭与菌剂配施使土壤中链霉菌的数量及比例显著高于对照, 但使小单孢菌的数量降低。由此可以看出, 生防放线菌配施棉秆炭能提高连作棉田土壤中生防放线菌的数量, 增强生防菌制剂的防病促生作用, 改善连作棉田土壤微生物群落结构, 在防控棉花连作障碍上具有较大的应用潜力。
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